1、绘制材料

(相关资料图)

2、应尽快取新鲜材料，防止死后组织发生变化。

3、使急速冷冻

4、1.将组织块平放在软塑料瓶盖或特制的小盒子(直径约2cm)中。

5、2.如果组织块足够小，可以将组织浸入OCT包埋剂中，慢慢将专用盒平放入装有液氮的小杯中。

6、3.当盒子底部与液氮接触时，它开始蒸发和沸腾。此时小盒子不要浸入液氮中，组织会在10-20s左右迅速冻成块状。

7、4.做成冻块后可以放入冷冻切片机冰冻切片。

8、5.如需保存，应迅速用铝箔或塑料薄膜包装，立即放入-80冰箱保存。

9、固定的；不变的

10、1.在样品架上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织放在上面，放入4冰箱预冷5-10分钟，让OCT胶浸透组织。

11、2.取出组织，放在锡纸或载玻片上，样品被迅速冷冻。

12、3.将组织放在样品架上，上面加一层OCT胶，以完全覆盖为宜，放在速冻架(PE)上30min。

13、切片

14、1.恒温冰冻切片机比较理想冰冻切片机。它的基本结构是将切片机放在低温密闭室内，所以切片时不受外界温度和环境的影响，可以连续切片到5-10 m。

15、2.切片时，低温时室内温度应为-15 ~-20。温度过低，组织容易破碎，防卷板的位置和角度要合适。载玻片应贴在组织切片上，严禁上下移动。

16、3.切割后室温静置30分钟，在4的丙酮中固定5-10分钟，在烘箱中干燥20分钟。PBS洗涤5min3次。

17、4、抗原热修复、微波热修复、室温自然冷却。用3%H2O2孵育5-10分钟可消除内源过氧化物酶的活性。

18、免疫荧光染色

19、1.冰冻切片室温干燥15min，室温下用含10%正常山羊血清的PBS切片1小时(此步骤不需要)。

20、2.滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体量视组织大小而定，原则是能均匀覆盖组织表面，全程不会干涸)。

21、3.将切片放入含PBS的免疫组织化学湿盒中，室温孵育2小时或4过夜。

22、4.第二天，将湿盒放在37下保温1小时，然后吸取切片上的一抗进行回收，将切片插入小染缸中进行PBS洗涤。

23、5.滴加用PBS(深色)稀释的二抗，置于分子杂交盒中，37孵育1小时。回收二抗，染缸切片，PBS洗5分钟 3次。

24、6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。

25、7、回收DAPI，滴加5-10l抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

26、8、做好的切片放在切片盒内，置于4冰箱，可保存一周左右。

以上就是冰冻切片这篇文章的一些介绍，希望对大家有所帮助。

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